Laboratóriumi Eredmények: Polimeráz Láncreakció (PCR)

2023 Szerző: Wallace Forman | [email protected]. Utoljára módosítva: 2023-05-24 12:25

Laboratóriumi eredmények: polimeráz láncreakció (PCR)

A polimeráz láncreakció (PCR) a legfontosabb laboratóriumi módszer a genetikai anyag finom molekuláris szerkezetének vizsgálatához. Ez dezoxiribonukleinsavból (DNS) áll, amely felépíti az emberek, de az állatok és a növények genetikai kódját is.

Az emberi orvoslásban a PCR-t az örökletes betegségek és genetikai kérdések (a betegség kockázata, az apasági teszt stb.) Tisztázására használják, de számos fertőző betegség diagnosztizálásában is. A szerológiai diagnosztikával (a vérben lévő kórokozók elleni antitestek meghatározása) ellentétben a PCR módszerek közvetlen laboratóriumi orvosi kimutatási módszert jelentenek a fertőző betegségek tisztázására.

A PCR előnye egyrészt a vizsgálati eredmények gyors elérhetősége. Ezenkívül a PCR módszerek általában nagyon érzékenyek.

navigáció

• olvasson tovább
• többet a témáról
• Tanácsok, letöltések és eszközök
• Mi a polimeráz láncreakció (PCR) és mit vizsgálnak?
• Hogyan működik a PCR?
• Milyen vizsgálati eredményeket nyújt a PCR?
• Van-e további fejlődés a hagyományos PCR-ben?
• Melyek a PCR fő alkalmazási területei?
• Vannak referenciaértékek a PCR teszt eredményeihez?

Ez azt jelenti, hogy a kórokozó (baktériumok, vírusok stb.) Legkisebb genetikai anyagának mennyisége is megbízhatóan pozitív eredményhez vezet a megfelelő kórokozó kimutatási időszakában a megfelelő vizsgálati anyagban. Elsősorban vért, de egyéb testnedveket (köpet, vizelet, folyadék stb.) Is használnak vizsgálati anyagként a PCR-módszerekhez.

Mi a polimeráz láncreakció (PCR) és mit vizsgálnak?

A polimeráz láncreakció ("Polimeráz láncreakció" - PCR) a legfontosabb laboratóriumi módszer a genetikai anyag finom molekulaszerkezetének vizsgálatához. Ezért ezt a vizsgálati eljárást ún

„Molekuláris diagnosztika”

A genetikai anyag (más néven "genetikai anyag") alapja egy speciális, hosszú láncú molekula:

a "DNS" (dezoxiribonukleinsav)

Emberben a kettős szálú DNS-ből (két komplementer szál) álló genetikai anyag az összes testsejt magjában található, ahol az egyén összes testsejtje azonos genetikai anyaggal rendelkezik. Ezenkívül az egyes személyek genetikai összetételének pontos összetétele egyedi - összehasonlítható az ujjlenyomattal, amely szintén egyedi minden ember számára.

Emiatt a genetikai anyagot is nevezik

A "genetikai kód" azt jelenti, hogy egy személy összes testszerkezetének tervrajza ebben a titkosított formában van feltérképezve, és így mentésre kerül, és továbbadható

A test sejtjeinek sejtmagjain belül a DNS egy speciális sorrendben ismert

A "kromoszómákat" (örökletes testeket) nevezzük. Ezek mindig párban fordulnak elő az emberi test sejtjeiben, az egyiket az anyától, a másikat az apától öröklik. Ebben az értelemben egy személy összes testsejtje összesen 46 kromoszómát tartalmaz - 22 pár úgynevezett autoszómát és egy pár úgynevezett nemi kromoszómát

A PCR laboratóriumi módszerének segítségével egyrészt megvizsgálható az emberi DNS finom szerkezete, ami fontos a betegségek diagnosztizálásakor vagy konkrét kérdések tisztázásakor:

• Örökletes betegségek tisztázása,
• A betegség kockázatának értékelése,
• Az anyagcsere veleszületett sajátosságainak vizsgálata,
• törvényszéki (úgynevezett "törvényszéki") elemzés (pl. az apaság igazolása) és még sok más

Másrészt az embereknek nemcsak megfelelő genetikai felépítése van, hanem valójában a föld minden életformájának sajátos genetikai felépítése van:

• Állatok,
• Növények,
• Gomba,
• Baktériumok,
• Vírusok,
• Paraziták stb.

Ezen életformák genetikai felépítése szintén főleg DNS-ből áll, vagy egyes vírusok esetén az RNS-ből (ribonukleinsav) is, amely a DNS-sel ellentétben egyszálú. Az orvosi diagnosztikában a PCR-t ezért számos fertőző betegség tisztázására is használják:

• bakteriális fertőzések (pl. tuberkulózis, bakteriális nemi úton terjedő betegségek),
• vírusfertőzések (pl. vírusos hepatitis, HIV-fertőzés),
• parazita fertőzések (pl. malária) és még sok más

Hogyan működik a PCR?

A PCR-módszert Kary B. Mullis amerikai biokémikus fejlesztette ki 1983-ban, és alapvetően két alapelven alapszik:

• A genetikai anyag (DNS vagy RNS) kis részének szaporodása ("amplifikációja") is
• Az amplifikáció megsokszorozott ("amplifikált") termékeinek kimutatása és azonosítása.

Ennek megfelelően a következő komponensekre van szükség a PCR elvégzéséhez:

• vizsgálati anyag (pl. vér-, sejt- vagy szövetminták),
• bizonyos reagensek ("polimeráz", "primer", "nukleotidok" (ezek a DNS építőkövei) stb.) és laboratóriumi berendezések a genetikai anyag amplifikálására is
• detektáló rendszer a PCR-termékekhez.

A PCR elvégzéséhez szükséges reagenseket és laboratóriumi felszerelést illetően a következő enzim áll a teljes PCR-folyamat középpontjában:

a Taq-polimeráz

Ez egy enzim, amelyet a "Thermus aquarius" (Taq) mikroorganizmusból nyernek - egy baktérium törzs, amely forró, vulkanikus források közelében található, és a környezete magas hőmérsékletéhez igazodva képes túlélni.

A Taq-polimeráz különlegessége, hogy ez az enzim 50 ° C (C) feletti magas hőmérsékleten is képes ellátni funkcióját, nevezetesen

a DNS szaporodása ("amplifikációja")

A Taq-polimeráz mellett a PCR-elemzés előtt pontosan meg kell határozni, hogy a DNS melyik részét kell megvizsgálni. Erre a célra rövid DNS-fragmensekre van szükség, amelyek finom szerkezete megfelel a DNS célterületének a megfelelő genetikai kód („DNS-szekvencia) szempontjából. Ezeket a DNS-fragmenseket ún

"Primer" hívott

A tényleges amplifikációs folyamat egy PCR kontextusában végül a következő lépéseket tartalmazza:

• A genetikai anyag (DNS vagy RNS) kivonása a vizsgálati anyagból.

  Az RNS vizsgálatakor a ribonukleinsav kódszekvenciát először DNS kód szekvenciává kell átalakítani, amelyet a tényleges amplifikáció előtt analitikai lépésben a "reverz transzkriptáz" enzimmel kell elvégezni

• A genetikai anyag amplifikálása több lépésben ("ciklusok"):

  • Első lépés - "DNS denaturáció": a kétszálú DNS melegítésével (95 ° C) egyetlen szálakká olvasztjuk.
  • Második lépés - „lágyítás”: alacsonyabb hőmérsékleten (kb. 55 ° C) az „láncindítók” mostantól kapcsolódhatnak a DNS célszekvenciájukhoz.
  • Harmadik lépés - "megnyúlás": 72 ° C-os hőmérsékleten a Taq-polimeráz enzim az úgynevezett "nukleotidok" (ezek a DNS-építőelemek) felhasználásával kiterjeszti ("megnyújtja") a primer indítási szekvenciáját és felépíti azt így egy új, hosszúkás DNS-molekula.

Mivel az első-két lépést több ciklusban megismétlik, egyre hosszabb és újabb újonnan képződő DNS-láncok jönnek létre, és e laboratóriumi eljárás neve a „polimeráz-láncreakció”.

• Az újonnan létrehozott DNS-láncok (úgynevezett "PCR-termékek") elemzése:

  A láncreakció (ciklusok) végén a PCR-termékeket - azaz az újonnan létrehozott DNS-molekulákat - minőségileg vagy mennyiségileg megvizsgálják és értékelik. Számos lehetőség kínálkozik erre az értékelésre, többnyire a DNS festésén (főleg fluoreszcens festékeken) és annak láthatóvá tételén (gélelektroforézis vagy fotometrikus fluoreszcencia detektálás útján)

Milyen vizsgálati eredményeket nyújt a PCR?

A modern PCR módszerek eredményei két csoportban foglalhatók össze:

• minőségi és
• mennyiségi eredmények.

A kvalitatív PCR-ben azt vizsgálják, hogy a genetikai anyag (DNS vagy RNS) egy bizonyos szakasza jelen van-e a vizsgálati anyagban („pozitív” eredmény) vagy sem („negatív” eredmény).

A kvalitatív PCR-t tehát elsősorban a következő diagnosztikai kérdések ("igen / nem" eredmények) tisztázására használják:

• Örökletes betegségek diagnózisa,
• Mutációk tisztázása,
• A genetikai jellemzők felismerése (pl. Bizonyos betegségekre való hajlam) stb.

A kvantitatív PCR ennek a laboratóriumi módszernek a továbbfejlesztése, amelynek során nemcsak a genetikai anyag egy bizonyos területének jelenlétét detektálják, hanem a genetikai anyag mennyiségét is. Ennek megfelelően a kvantitatív PCR-t elsősorban az orvostudomány következő területein alkalmazzák:

• A fertőzés diagnózisának részeként pontosan meghatározható a kórokozók mennyisége a beteg testében. Vírusfertőzések esetén ezt a PCR-módszert alkalmazzák az ún

  Vírusterhelés vizsgálva

Ezenkívül a kvantitatív PCR az alapkutatásban is nagyon fontos, mivel nemcsak a humán orvoslás, hanem számos más tudományos terület (állatgyógyászat, biokémia, biológia stb.) Is profitál ebből a folyamatból.

A PCR előnye a fertőző betegségek diagnosztizálásában, hogy ennek a laboratóriumi módszernek a vizsgálati eredményei rendkívül gyorsan (általában egy munkanapon belül) állnak rendelkezésre. Ezenkívül a PCR rendkívül érzékeny laboratóriumi módszer. Ez azt jelenti, hogy a vizsgálati anyagban a legkisebb baktérium- vagy vírusmennyiség is megbízhatóan pozitív eredményhez vezet.

Van-e további fejlődés a hagyományos PCR-ben?

A PCR módszertan speciális továbbfejlesztése a

Multiplex PCR

A multiplex PCR-ben egyszerre több DNS-célszekvenciát (olvashatunk: több primert) használunk. Ez olyan PCR-termékek keverékét hozza létre, amelyeket ennek megfelelően kell kimutatni és értékelni.

A multiplex PCR-t elsősorban az orvostudományban is alkalmazzák

• az emberi genetika is
• a fertőzés diagnózisa.

Ennek a módszernek az az előnye, hogy összességében kevesebb vizsgálati anyagot kell beszerezni a betegektől, és egy vizsgálati eredmény sorozat hozható létre egy elemzési lépésben. Ezeket a diagnosztikai előnyöket azonban sok esetben ellensúlyozza az elemzés magas ára.

A PCR alkalmazásának másik különlegessége a

DNS szekvenálás

Ez egy diagnosztikai lehetőség a genetikai kód pontos szekvenciájának megfejtésére a betegben. A szekvenálási módszer alapulhat PCR technológián is.

Mivel azonban a szekvenálás lényegesen összetettebb és költségesebb, mint a hagyományos PCR-módszerek, jelenleg speciális diagnosztikai (kiterjesztett genomelemzések) és tudományos kérdések számára van fenntartva.

Melyek a PCR fő alkalmazási területei?

A PCR alkalmazásának területeit illetően ezt a laboratóriumi eljárást a következő diagnosztikai kérdésekre használják:

• Örökletes betegségek tisztázása - már több mint 600 különböző örökletes betegségre léteznek PCR módszerek.
• Farmakogenetika - a máj metabolizmusának genetikai jellemzőinek tanulmányozásával következtetéseket lehet levonni a gyógyszerek hatékonyságáról és adagolásáról.
• Daganatos gyógyszer ("onkológia") - itt egyrészt a PCR-t használják bizonyos daganatos megbetegedések (pl. Emlőrák) kockázati tényezőinek tisztázására. Másrészt a daganatok sejtjei és szövetei is megvizsgálhatók a különféle mutációk tekintetében, amelyek egyre fontosabb szerepet játszanak különösen e betegségek kezelésében.
• Törvényszéki orvostan ("kriminalisztika") - itt a PCR-nek nagy jelentősége van például az apasági eljárásokban és a kriminológiában ("DNS-ujjlenyomatok").
• Fertőző gyógyszer - A PCR elengedhetetlen értéke a bakteriális, vírusos és parazita fertőző betegségek diagnosztizálásában, előrehaladásában és terápiás ellenőrzésében.

A rákkal kapcsolatos további információkért lásd: Rák.

Vannak referenciaértékek a PCR teszt eredményeihez?

A PCR módszerek referenciaértékeit illetően mindig figyelembe kell venni a megfelelő diagnosztikai kérdést. Mivel bizonyos genetikai jellemzőket az örökletes betegségek vizsgálata (pl. Mutációelemzés) részeként detektálnak, az ilyen laboratóriumi elemzésekben nincs referenciaérték („pozitív” vagy „negatív”), mint ahogy például a hajszínre sem vonatkozik referenciaérték. Mivel a hajszín genetikai jellegzetesség is.

Ezenkívül a veleszületett örökletes tulajdonságok laboratóriumi elemzéseire ebben az országban szigorú előírások vonatkoznak, amelyekre az osztrák géntechnikai törvény (GTG) rendelkezései a mérvadók (a létező betegség meghatározása a GTG 65. szakasza szerint). Ennek eredményeként ezt az elemzést az orvosi laboratórium csak azután végezheti el, hogy írásbeli igazolást kapott a vizsgálandó személytől, a törvényes gyámtól (döntéshozatalra képtelen kiskorúak esetében) vagy a törvényes képviselőtől (olyan életkorú személyek esetében, akik képtelenek dönteni) az általuk nyújtott átfogó információkról. a kezelőorvost e genetikai teszt tekintetében kell elvégezni (a GTG 69. szakasza).

Ezenkívül a betegeknek általában joguk van megtiltani a genetikai vizsgálatok elvégzését saját magukon.

A nem emberi genetikai PCR laboratóriumi elemzésekre azonban sokkal kevésbé szigorú előírások vonatkoznak. Leginkább laboratóriumi módszereket érint a fertőzés diagnosztizálásának területén.

E laboratóriumi módszerek referenciaértékeit tekintve meg kell különböztetni a kvalitatív és a kvantitatív módszereket:

A kvalitatív PCR módszerek általában „pozitív” vagy „negatív” eredményt adnak, ezáltal a „negatív” általában a referenciaérték

A kvantitatív PCR-módszerrel a módszertől függően megfelelő küszöbértékeket (úgynevezett "cut-off" -okat) határoznak meg, amelyektől kezdve az eredményt kórosnak kell értékelni.